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新型熒光蛋白可用于活細胞觀察
日期：2025-05-11 10:44
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摘要：
來自德國卡爾斯魯厄理工學院等處的研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的，來自珊瑚蟲的熒光蛋白，這種熒光蛋白可以用于高分辨率顯微鏡下觀察活細胞。這一研究成果公布在《自然—方法學》（Nature Methods）雜志上。 領導這一研究的是有名的蛋白質(zhì)相互作用分析專家：Gerd Ulrich Nienhaus，這位科學家著有《Methods in Molecular Biology: Protein-Ligand Interactions》，詳細分析了蛋白與配基相互作用研究中的方法分析。 熒光蛋白是由很多能產(chǎn)生五彩斑斕的海洋動物產(chǎn)生的，包括綠色熒光蛋白，黃色熒光蛋白，紅色熒光蛋白，橙色熒光蛋白等，這些熒光蛋白有些來自水母，有些來自珊瑚，近年來分子生物學家門從中提取出了很多種熒光蛋白及它們的基因，并用基因工程建立了一系列具有不同發(fā)光特性的熒光蛋白。 人們在對熒光蛋白變體復雜的光物理學特性的研究過程中，找到了可被兩種方式激活的發(fā)色團，它們可從靜息態(tài)發(fā)射熒光（即光激活）或者發(fā)生熒光發(fā)射帶寬的轉(zhuǎn)變（即光轉(zhuǎn)化）。這些蛋白出現(xiàn)后被作為一種新型的探針，在活細胞成像中及對蛋白質(zhì)動力學的研究中*為理想。 而*新的研究則在珊瑚蟲及其親緣物種發(fā)現(xiàn)了新型熒光色素，這為生產(chǎn)生化研究用的先進標記物提供了無價的先導結構，這項研究*重要的意義是在活體細胞中的非侵入式動態(tài)過程研究。 這種蛋白即EosFP，一種從造礁紅色腦珊瑚中提取出來的熒光蛋白。基因工程使Iris熒光蛋白具有雙重光激活的特性。**種方式下，Iris蛋白在紫光的照射下，會發(fā)生不可逆的“光轉(zhuǎn)化”——從發(fā)綠光變成發(fā)紅光。在**種方式下，在用不同波長的光照射時，這種蛋白會或多或少改變它的這兩種發(fā)光方式。 這種造礁紅色腦珊瑚：Lobophyllia hemprichii主要位于印度洋至太平洋的珊瑚礁海域，具有一定攻擊性，在夜晚會伸展出觸須蟄刺臨近的珊瑚，這種珊瑚的顏色包括亮紅色、綠色、橘色、灰色、棕色、褐色。 傳統(tǒng)的光活化熒光蛋白PA-FPs（包括PA-GFP等在內(nèi)）的光活化突變體是將野生型中性蛋白質(zhì)改造為陰離子態(tài)得來的，比如PA-GFP在穩(wěn)定狀態(tài)時，野生型綠色熒光蛋白在395和475nm處分別有一大一小兩個吸收峰。當用強紫外或紫光照射該蛋白時，發(fā)色團產(chǎn)生光轉(zhuǎn)化，從而改變了大小兩個吸收峰的相對消光系數(shù)的比值。結果是在488nm激發(fā)下，發(fā)射熒光的強度比未刺激前增加了3倍。 這種蛋白通常會融合在目的蛋白上，并且在活細胞中表達。使用特定波長的激光照射細胞中的一些區(qū)域，蛋白標記就會在另一個波長上發(fā)光。這就使在顯微鏡下研究活細胞內(nèi)的動態(tài)過程成為可能。天然狀態(tài)下，四個IrisFP分子會形成一個四聚體，這會給融合蛋白的應用帶來麻煩，為了避免這個問題，研究者們修飾了這個蛋白，造成了四個突變。這就是的單獨的IrisFP更加穩(wěn)定，減少了它們形成四聚體的可能。研究人員認為這種單體的mIrisFP保留了它雙重光激活的特性，而且非常合適作為遺傳編碼的熒光蛋白標記。 熒光顯微在細胞學科學研究中作為一種非破壞性，靈敏技術使亞細胞結構可視化和監(jiān)測細胞內(nèi)蛋白移動而已被廣泛地應用，今天的活細胞成像已經(jīng)從單純的結構或細胞器分析，轉(zhuǎn)向?qū)δ艿南嗷ビ绊懹^察與研究，科學家想在*真實的動態(tài)、三維、多標記條件下觀察自然，需要更先進的成像條件。 在這篇文章中，研究人員還將mIrisFP與多種其他蛋白在細胞中融合表達，證明了mIrisFP的應用普遍性，研究人員還將脈沖追蹤與熒光激活定位顯微鏡成像技術相結合，在高空間分辨率下跟蹤了熒光標記融合蛋白的運動。 為定位特異性生物分子在一個細胞內(nèi)用熒光顯微鏡要求生物分子用適當熒光團標記。經(jīng)典地通過有機熒光染料(如熒光素)結合至識別目標結構的一個配基或一個抗體標記分子。但是，如配基表位（epitope）或基于-抗體熒光標記不暴露至細胞外介質(zhì)，細胞必須被固定和去垢劑-透性前應用熒光檢測試劑。 近年來FPs已被開發(fā)成為熒光顯微鏡的強有力工具。**個被發(fā)現(xiàn)的FP是來自水母（Aequorea）victoria（avGFP）綠色FP，它轉(zhuǎn)換生成的生物發(fā)光能量被近端螢光素酶通過共振能量變換為綠色熒光。 而在活細胞中跨越至紅色熒光研究來自在非-生物發(fā)光珊瑚蟲綱（anthozoa）avGFP同源物的發(fā)現(xiàn)。珊瑚蟲綱FPs和avGFP間有相對小相似性，氨基酸序列水平有20%左右相同。 這種珊瑚蟲綱FPs的熒光延伸至可見光譜的紅**和使活-細胞多重復用的進一步水平。比如近期澳大利亞的研究人員也在澳大利亞發(fā)現(xiàn)大量熒光珊瑚。這些珊瑚有助于研究人員研究癌細胞并更好地了解全球氣候變化。 他們在位于澳洲大陸以東大約600公里處的豪勛爵島附近海域，發(fā)現(xiàn)“數(shù)以百計深綠色、藍色和散發(fā)著紅色熒光”的珊瑚。研究人員將令珊瑚泛光的基因“植入”健康細胞和癌細胞的分子中，隨后通過一種特制的感光顯微鏡觀察兩種細胞的生長和變化過程。薩利赫說，研究人員將利用這些熒光基因“點亮”活體細胞，觀察它們的機理，研究癌細胞與健康細胞的不同之處。薩利赫認為，這些熒光分子正在改變細胞科學和生物醫(yī)學的研究方式。
